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                    注意!使用ecL化學(xué)發(fā)光液一定要明白這幾點

                    更新時間:2018-11-22      點擊次數(shù):9125
                        ecL化學(xué)發(fā)光液的使用方法,執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、洗膜。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。推薦將一抗?jié)舛认♂尩?.5ug/ml(0.05~1ug/ml均可)將二抗?jié)舛认♂尩?.02ug/mL(0.005~0.04ug/mL均可)后1次洗膜的同時,新鮮配制發(fā)光工作液:根據(jù)用量將兩種組份按1:1比例混合均勻,備用。注:1)短時間暴露于日光燈下不會損害該工作液,但為獲得佳結(jié)果,將此工作液保存在棕色瓶中,避免暴露于任何強光。
                        取A液和B液一定要用不同的槍頭,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。用平頭鑷取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液,勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上(推薦150μl發(fā)光液/cm2膜),使之充分接觸。室溫孵育5分鐘,準備立即壓片曝光。用平頭鑷子夾起膜,膜的下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余的液體,留下少量工作液,不可讓膜*干燥。
                        在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上,將保鮮膜折起來*包裹印跡膜,去除氣泡和皺褶,可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi),蛋白條帶面向上。在黑暗中將X感光膠片放置在包裹的保鮮膜上,根據(jù)蛋白濃度曝光適當(dāng)時間(根據(jù)光強度需摸索曝光時間,一般30s-2min),顯影沖洗。注:根據(jù)經(jīng)驗,如果背景過高,可使用兩張X感光膠片同時壓片。
                        ecL化學(xué)發(fā)光液的注意事項,步驟1~5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。長時間曝光或蛋白過量,將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見,低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光,因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳,可用洗膜緩沖液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL發(fā)光和曝光。由于超敏發(fā)光液極其靈敏,強烈推薦大多數(shù)進口抗體起始濃度為一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶,導(dǎo)致失敗。某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光,應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性,回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3,如必需使用勿超過0.01%。
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